Millipore - Kit per la preparazione di DNA plasmidico e di BAC nel formato a 96 pozzetti

Kit Montage Plasmid Miniprep_HTS 96

Il kit Montage Plasmid Miniprep_HTS 96 è una soluzione rapida e di semplice impiego per la preparazione di DNA plasmidico o di cromosomi batterici artificiali (BAC) ad elevata purezza. Applicando una tecnologia di separazione brevettata ad un protocollo semplice, privo di lunghi procedimenti di adsorbimento/eluizione e di fasi di centrifugazione, il kit produce in modo riproducibile DNA puro, nel 50% del tempo necessario con i metodi tradizionali.

I prodotti della PCR purificati sono adatti anche per le applicazioni più sensibili, quali clonazione, sequenziamento o trasformazione del DNA. Tra le applicazioni dei BAC citiamo sequenziamento, fingerprinting, array e PCR.

Il kit comprende tutti i reagenti ed i consumabili necessari a purificare il DNA plasmidico o i BAC nel formato a 96 pozzetti. Subito dopo la lisi batterica, tre brevi passaggi di filtrazione sono tutto ciò che occorre per ottenere da ogni piastra 96 campioni di DNA purificato.

Il kit Montage Plasmid Miniprep_HTS 96 è ideale per l'impiego con i sistemi automatizzati per il trasferimento dei liquidi. Infatti, la modalità di raccolta dei campioni purificati dall'alto della piastra e l'assenza di lunghi passaggi di centrifugazione aumentano la compatibilità del kit con un gran numero di sistemi.

Componenti

Componente	Funzione
Piastra di coltura a 96 pozzetti deep well	Crescita della coltura batterica
Piastra Plasmid	Purificazione del DNA plasmidico
Piastra di chiarifica del lisato	Chiarifica dei lisati batterici
Piastra con fondo a V	Conservazione dei campioni di DNA plasmidico
Nastro sigillante	Sigilla la piastra di conservazione con fondo a V
RNasi A	Additivo richiesto per la Soluzione 1
Soluzione 1	Risospensione delle cellule
Soluzione 2	Lisi cellulare
Soluzione 3	Neutralizzazione
Soluzione 4	Lavaggio
Soluzione 5	Risospensione/conservazione del DNA plasmidico
Pellicola sigillante	Sigilla le piastre durante la crescita della coltura (deve essere perforata)
Per maggiori informazioni sui componenti del kit, consultare il manuale d'uso del kit Montage Plasmid Miniprep_HTS 96, oppure visitare il sito web presso www.millipore.com/montage.

Protocollo per la preparazione di DNA plasmidico

Il protocollo per la preparazione di DNA BAC è disponibile nel manuale d'uso del kit Montage Plasmid Miniprep_HTS, P36315.

1.	Dopo la lisi batterica, trasferire i lisati dalla piastra di coltura tipo deep well alla piastra di chiarifica. Filtrare i lisati col vuoto, chiarificandoli e raccogliendoli nella piastra plasmid.
2.	Collocare la piastra plasmid sopra il supporto di filtrazione ed applicare il vuoto per 5 - 7 minuti, per concentrare i campioni. Il DNA plasmidico sarà trattenuto sulla superficie della membrana, mentre i contaminanti saranno eliminati con la filtrazione. Aggiungere la soluzione di lavaggio e filtrare per 3 - 5 minuti.
3.	Aggiungere il tampone di risospensione e raccogliere i campioni purificati aspirandoli dall'alto.
4.	Trasferire i campioni nella piastra con fondo a V per l'uso o la conservazione.

Prestazioni — DNA plasmidico

Qualità elevata

Questo gel di agarosio mostra qualità e riproducibilità del DNA plasmidico purificato con il kit Montage Plasmid Miniprep_HTS 96 (MW- fago lambda digerito con Hind III).

Rese elevate*
Ceppo batterico	Plasmide	Resa (µg)
XL 1-blue	pUC19	2,1 – 6,1
XL 1-blue	pLH2**	3,5 – 9,2
JM109	pUC19	2,4 – 6,4
JM109	pLH2**	3,5 – 9,1
I risultati possono variare in funzione del ceppo batterico, del plasmide e delle condizioni del protocollo. *pLH2 deriva da pUC19. Il frammento da 2,0 Kb di l fago digerito con Hind III è stato clonato nel sito Hin*d III del plasmide pUC19, dando luogo ad un plasmide di 4,7 Kb.

Risultati affidabili
Ceppo batterico	Plasmide	Lunghezza di lettura media (n=24; accuratezza > 98%)	Phred medio q > 20 basi (n = 24)
XL1-blue	pUC19	707	618
XL1-blue	pLH2	658	623
JM109	pUC19	706	602
JM109	pLH2	695	543
Sequenze di plasmidi preparati con il kit Montage Plasmid Miniprep_HTS 96. Tutti i campioni sono stati sequenziati utilizzando regenti BigDye ed analizzati su sequenziatore capillare MegaBACE®. Nelle reazioni sono stati utilizzati rispettivamente 160 ng di pLH2 e 100 ng di pUC19. I prodotti di reazione sono stati purificati con un kit Montage SEQ₃₈₄.

Prestazioni — DNA BAC

Grande velocità ed elevate prestazioni
Tempo necessario	56 minuti
Resa media (µg/pozzetto)	0,86 (± 0,28)
Phred medio per 20 basi	411 (± 152)
Tasso di successo (% dei pozzetti con Phred > 100 per 20 basi)	90
Dati ottenuti con 96 cloni BAC (libreria del cromosoma umano 22, piastra #4, Research Genetics, Inc.) Il DNA BAC è stato isolato dai 96 cloni con il kit Montage Plasmid Miniprep_HTS 96. Il tempo è stato misurato a partire dalla fase precedente la lisi cellulare (pellet) e comprende il tempo di risospensione del DNA. La resa di DNA è stata misurata mediante determinazine fluorometrica con il colorante per gli acidi nucleici SYBR® green I (Molecular Probes, Inc.). Le preparazioni di DNA sono state sequenziate ottimizzando la reazione con BigDye® v. 3.0 (Applied Biosystems, Inc.) e la sequenza dei cicli. I prodotti di reazione sono stati purificati con piastre Montage SEQ₃₈₄ prima dell'iniezione in un sequenziatore ABI 3700 . Per tasso di successo si intende la percentuale dei 96 cloni che hanno ottenuto Phred di almeno 100 per 20 basi.

Il DNA BAC purificato con il kit Montage Plasmid Miniprep_HTS 96 è stato sciolto in 35 µL di tampone di risospensione (soluzione 5 del kit) e 10 µL del DNA sono stati utilizzati per il sequenziamento in una reazione con BigDye v. 3.0 (rapporto 3/8 ), come descritto nel protocollo ottimizzato del kit. I prodotti di reazione sono stati purificati con una piastra Montage SEQ₃₈₄ ed iniettati in un sequenziatore capillare ABI 3700.

DNA cromosomiale

Il DNA di tre diversi cloni BAC appartenenti ad una libreria di DNA del cromosoma 22 umano (Research Genetics, Inc.) è stato purificato con il kit Montage Plasmid Miniprep_HTS 96; si è, quindi, effettuata una corsa elettroforetica di 120 min a 100 V su gel di agarosio allo 0,8% sia del DNA tal quale (corsie 1 – 3), sia dopo digestione con Not I (corsie 4 – 6) o Hind III (corsie 7 – 9). La corsia M è un frammento di fago Lambda digerito con Hind III. Il DNA BAC purificato con il kit Montage Plasmid Miniprep_HTS 96 è adatto per scopi di fingerprinting.

Paragonare	Numero di catalogo	Descrizione	Qtà/conf
	LSKP09604	Kit Montage Plasmid Miniprep_HTS 96	4	» Aggiungere all'ordine
	LSKP09624	Kit Montage Plasmid Miniprep_HTS 96	24	» Aggiungere all'ordine

Paragonare	Numero di catalogo	Descrizione	Qtà/conf
	LSKCCB050	Piastre per coltura batterica tipo Deep Well, con coperchio	50	» Aggiungere all'ordine
	LSKP38450	Piastre Plasmid Miniprep a 384 pozzetti per la chiarifica dei lisati batterici	50	» Aggiungere all'ordine
	SCGVU01RE	Filtri Stericup-GV da 0,22 µm, PVDF, 150 mL, sterilizzati a raggi gamma	12	» Aggiungere all'ordine
	LSKAST100	Pellicola adesiva sigilla-piastre	100	» Aggiungere all'ordine

Paragonare	Numero di catalogo	Descrizione	Qtà/conf
	MSVMHTS00	Supporto da vuoto per piastre MultiScreen_HTS	1	» Aggiungere all'ordine
	LSKVBP100	Piastre con fondo a V	100	» Aggiungere all'ordine
	WP6111560	Pompa Chemical Duty, 115 V/60 Hz	1	» Aggiungere all'ordine
	WP6122050	Pompa Chemical Duty, 220 V/50 Hz	1	» Aggiungere all'ordine
	WP6110060	Pompa Chemical Duty, 100 V/50–60 Hz	1	» Aggiungere all'ordine

Paragonare	Numero di catalogo	Descrizione	Volume, mL
	LSKCRS500	Soluzione di risospensione cellulare, 0,5 L	500	» Aggiungere all'ordine
	LSKCLS500	Soluzione di lisi cellulare, 0,5 L	500	» Aggiungere all'ordine
	LSKNS0500	Soluzione di neutralizzazione, 0,5 L	500	» Aggiungere all'ordine
	LSKNF0500	Acqua priva di nucleasi, 0,5 L	500	» Aggiungere all'ordine
	LSKCTB500	Tampone Tris, 0,5 L	500	» Aggiungere all'ordine
	LSKPMRN30	RNasi A, 0,9 mL	0,9	» Aggiungere all'ordine