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Northern e Southern Blotting, Colony e Plaque Lift

Membrane da blotting Immobilon™-Ny+ in nylon caricato ed Immobilon-NC

Millipore offre una vasta gamma di membrane da blotting per diverse applicazioni con gli acidi nucleici. Per risultati di qualità superiore in tecniche di Southern blotting, northern blotting e colony/plaque lift, si consiglia l'impiego delle membrane da blotting caricate positivamente Immobilon-Ny+. Un'alternativa meno sensibile, ma anche molto economica, è rappresentata dalle membrane da blotting Immobilon-NC in nitrocellulosa, la prima matrice utilizzata per i protocolli di Southern e colony plaque lift.

Membrane da blotting Immobilon-Ny+ in nylon caricato

Le membrane in nylon con carica positiva Immobilon-Ny+ sono ottimizzate per garantire affidabilità e riproducibilità in trasferimenti, immobilizzazioni, ibridazioni e successivi reprobing. La densità e l'uniformità della carica positiva di superficie conferiscono massima sensibilità con background minimo. La membrana è rinforzata per poter offrire maggiore durata, particolarmente importante negli esperimenti di reprobing.

Per risultati ottimali nei trasferimenti con le membrane Immobilon-Ny+, sono disponibili protocolli dettagliati.

       • Massima sensibilità con background minimo
       • Caratteristiche eccezionali per gli esperimenti di reprobing
       • Buone prestazioni sia con i sistemi di rivelazione chemiluminescenti, sia radioattivi

Prestazioni

Southern Blotting

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Confronto diretto di tre membrane in nylon caricato utilizzate seguendo i protocolli ottimizzati per ciascuna: il cross-linking di ogni membrana è stato condotto alla lunghezza d'onda UV raccomandata. In queste condizioni, la membrana Immobilon-Ny+ ha mostrato un segnale di ibridazione doppio rispetto ad entrambe le membrane di aziende concorrenti.

Intensità del segnale dopo 12 cicli di reprobing

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Il cross-linking delle membrane in nylon è stato effettuato a 254 nm; le membrane sono state, quindi, sottoposte a numerosi cicli di reprobing, cioé, nell'ordine, due ibridazioni con sonda marcata con 32P, quattro "finte" ibridazioni, una settima ibridazione con sonda marcata con 32P seguita da cinque "finte ibridazioni" e da una tredicesima ibridazione con sonda marcata con 32P. Tra due cicli di ibridazione veniva eseguito un ciclo di stripping in NaOH 0,4 M a 45 °C per 30 minuti. Le "finte" ibridazioni venivano condotte esattamente come ibridazioni vere, ad eccezione della sonda che non era marcata con 32P. Nel corso del processo di reprobing, la membrana Immobilon-Ny+ ha offerto prestazioni migliori con segnali doppi rispetto ad entrambe le membrane in nylon caricate di aziende concorrenti A e B.

Sensibilità della visualizzazione

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L'efficienza nella visualizzazione, consente di caricare quantità minime di DNA, fino a 0,01 ng. Le bande di 2,2 e 2,0 kbp nella corsia 0,1 corrispondono, rispettivamente, a 0,48 e 0,42 pg di DNA, approssimativamente equivalenti alla sequenza di un gene in singola copia presente in 10 µg di DNA genomico umano. La sensibilità è stata migliorata raddoppiando la concentrazione della sonda. Nella corsia corrispondente a 0,01 ng, la membrana Immobilon-Ny+ mostra sensibilità un po' maggiore con background ridotto rispetto alla membrana A.

Northern Blotting con rivelazione in chemiluminescenza

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L'RNA totale da fegato di topo (1 µg) è stato fatto correre su gel di agarosio formaldeide e trasferito mediante blotting capillare su una Immobilon-Ny+ e su una membrana in nylon caricato positivamente di un'azienda concorrente "A". La fissazione dell'RNA mediante cross-linking agli UV ha aumentato l'intensità del segnale rispetto al baking. La membrana Immobilon-Ny+ mostra migliore sensibilità rispetto alla membrana prodotta dall'azienda "A".

Colony Lifts

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Una sospensione batterica mista di E. coli JM109 recanti i plasmidi pUC19 o pLH2 (frammento lungo 2,0 kpb di DNA di fago lambda digerito con Hind III e clonato nel pUC19) è stata piastrata su piastre di agar LB e messa ad incubare a 37 °C per una notte. Dopo raffreddamento delle piastre a 4 °C per 30 minuti, le colonie (diametro di circa 1–2 mm) sono state trasferite su un disco di 82 mm di membrana Immobilon-Ny+ o di una membrana in nylon caricato positivamente di un'azienda concorrente. Il DNA sulla membrana è stato sottoposto a cross-linking agli UV a 254 nm e 60.000 µJoules/cm2. Le membrane sono state quindi ibridizzate con una sonda di DNA marcata con 32P ed i risultati registrati con un sistema per la visualizzazione del forsoro.

Membrane da blotting Immobilon-NC

Le membrane Immobilon-NC rappresentano un'alternativa economica per il blotting di acidi nucleici e di proteine. Queste membrane da trasferimento in nitrocellulosa, sono state la prima matrice utilizzata per protocolli di Southern e Western blotting e per colony/plaque lift. Le membrane NC HATF sono costituite da una matrice in esteri misti di cellulosa priva dei tensioattivi che interferiscono con l'integrità della parete cellulare e con la crescita delle cellule e sono, pertanto, consigliate per le applicazioni di colony lift. Le membrane NC HAHY sono cosituite da esteri misti di cellulosa e contengono tensiattivi che ne migliorano la bagnabilità e ne agevolano la manipolazione durante il trasferimento. Entrambi i tipi di membrana sono caratterizzate da elevata capacità di binding per acidi nucleici e proteine e sono utilizzabili per i comuni scopi di blotting.


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Membrana da blotting Immobilon-Ny+ – Dischi

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Membrana da blotting Immobilon-NC esente da tensiattivi – Dischi

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Membrana da blotting Immobilon-NC – Dischi

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Membrana da blotting Immobilon-Ny+ – Fogli e rotoli

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Membrana da blotting Immobilon-NC – Fogli e rotoli

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