Northern e Southern Blotting, Colony e Plaque Lift

Southern Blotting

Confronto diretto di tre membrane in nylon caricato utilizzate seguendo i protocolli ottimizzati per ciascuna: il cross-linking di ogni membrana è stato condotto alla lunghezza d'onda UV raccomandata. In queste condizioni, la membrana Immobilon-Ny+ ha mostrato un segnale di ibridazione doppio rispetto ad entrambe le membrane di aziende concorrenti.

Intensità del segnale dopo 12 cicli di reprobing

Il cross-linking delle membrane in nylon è stato effettuato a 254 nm; le membrane sono state, quindi, sottoposte a numerosi cicli di reprobing, cioé, nell'ordine, due ibridazioni con sonda marcata con ³²P, quattro "finte" ibridazioni, una settima ibridazione con sonda marcata con ³²P seguita da cinque "finte ibridazioni" e da una tredicesima ibridazione con sonda marcata con ³²P. Tra due cicli di ibridazione veniva eseguito un ciclo di stripping in NaOH 0,4 M a 45 °C per 30 minuti. Le "finte" ibridazioni venivano condotte esattamente come ibridazioni vere, ad eccezione della sonda che non era marcata con ³²P. Nel corso del processo di reprobing, la membrana Immobilon-Ny+ ha offerto prestazioni migliori con segnali doppi rispetto ad entrambe le membrane in nylon caricate di aziende concorrenti A e B.

Sensibilità della visualizzazione

L'efficienza nella visualizzazione, consente di caricare quantità minime di DNA, fino a 0,01 ng. Le bande di 2,2 e 2,0 kbp nella corsia 0,1 corrispondono, rispettivamente, a 0,48 e 0,42 pg di DNA, approssimativamente equivalenti alla sequenza di un gene in singola copia presente in 10 µg di DNA genomico umano. La sensibilità è stata migliorata raddoppiando la concentrazione della sonda. Nella corsia corrispondente a 0,01 ng, la membrana Immobilon-Ny+ mostra sensibilità un po' maggiore con background ridotto rispetto alla membrana A.

Northern Blotting con rivelazione in chemiluminescenza

L'RNA totale da fegato di topo (1 µg) è stato fatto correre su gel di agarosio formaldeide e trasferito mediante blotting capillare su una Immobilon-Ny+ e su una membrana in nylon caricato positivamente di un'azienda concorrente "A". La fissazione dell'RNA mediante cross-linking agli UV ha aumentato l'intensità del segnale rispetto al baking. La membrana Immobilon-Ny+ mostra migliore sensibilità rispetto alla membrana prodotta dall'azienda "A".

Colony Lifts

Una sospensione batterica mista di E. coli JM109 recanti i plasmidi pUC19 o pLH2 (frammento lungo 2,0 kpb di DNA di fago lambda digerito con Hind III e clonato nel pUC19) è stata piastrata su piastre di agar LB e messa ad incubare a 37 °C per una notte. Dopo raffreddamento delle piastre a 4 °C per 30 minuti, le colonie (diametro di circa 1–2 mm) sono state trasferite su un disco di 82 mm di membrana Immobilon-Ny+ o di una membrana in nylon caricato positivamente di un'azienda concorrente. Il DNA sulla membrana è stato sottoposto a cross-linking agli UV a 254 nm e 60.000 µJoules/cm². Le membrane sono state quindi ibridizzate con una sonda di DNA marcata con ³²P ed i risultati registrati con un sistema per la visualizzazione del forsoro.