核酸ブロッティングおよびコロニーリフト

サザンブロッティング

3種類のチャージドナイロンメンブレンをそれぞれ至適化されたプロトコールで比較: 各メンブレンはそれぞれ推奨されているUV波長でクロスリンクした。このUVクロスリンキングの条件で、Immobilon-Ny+は、Competitor A および Competitor Bのどちらに対しても、2倍のハイブリダイゼーションシグナルを示した。

12回のリプロービング後のシグナル強度

ナイロンメンブレンを254 nmでクロスリンクし、順に、次のようにマルチプローブを行なった。³²P 標識プローブを用いて2回のハイブリダイゼーション、4回の模擬ハイブリダイゼーション、³²P 標識プローブを用いて7回目のハイブリダイゼーション、次に5回の模擬ハイブリダイゼーションおよび³²P 標識プローブを用いて13回目のハイブリダイゼーションを行った。各ハイブリダイゼーションサイクルの間に0.4 M NaOH に45℃、30分間で、メンブレンからプローブをストリップした。模擬ハイブリダイゼーションは、³²P 標識プローブを加えないだけで、その他は実際のハイブリダイゼーションと同様に行った。リプロービングプロセスを通して、Immobilon-Ny+はCompetitor AおよびBのチャージドナイロンメンブレンどちらに対しても、2倍のシグナル強度を示した。

検出感度

ゲルへローディングしたDNA量を0.01 ngまで希釈。0.1レーン中の2.2そして2.0 kbpバンドは0.48および0.42 pgのDNAに相当する。これはほぼ10 µgのヒトゲノムDNAに含まれるシングルコピーと同等である。プローブ濃度を2倍にして感度を向上させた。 0.01 ngレーンにおいて、Immobilon-Ny+はCompetitor Aに比べ、バックグランドは低く、やや高い感度を示した。

化学発光検出を用いたノーザンブロッティング

マウス肝臓トータルRNA (1 µg) をホルムアルデヒドアガロースゲルに溶解し、Immobilon-Ny+および競合品のポジティブチャージドナイロンメンブレン "A" にキャピラリーブロッティングによってトランスファーした。UVクロスリンキングによるRNAの固定は、ベーキングに比べシグナル感度を増した。Immobilon-Ny+は、Competitor Aに比べ高感度を示した。

コロニーリフト

pUC19またはpLH2 (pUC19の中にクローンしたラムダファージDNA Hind III の2.0 kbpフラグメント) を付帯しているJM109の混合バクテリア懸濁液をLBカンテンプレート上に延ばし、37℃で一晩培養した。そのプレートを4℃で30分間冷やした後、コロニー (直径およそ1 - 2 mm) をImmobilon-Ny+および競合品のポジティブチャージドナイロンの82 mm ディスクメンブレンにトランスファーした。メンブレン上のDNAを254 nm で60,000 µJoules/cm²にてUVクロスリンクした。その後メンブレンを³²P 標識したDNAプローブを使ってハイブリダイズし、phosphor imaging systemを使って可視化した。