細胞の凍結および融解プロトコール

1. 培養細胞凍結保存用培地を解凍し、ビンをゆっくりと回しながら充分に混合します。使用中は培地を氷冷しておきます。
2. 凍結する細胞は対数増殖期後半であることが重要です。
3. 単層培養細胞の場合は剥離させる必要があります。剥離後に細胞を完全増殖培地に再懸濁し、計数して生存率および細胞数を求めます。
4. 細胞を穏やかにペレット化します。ペレット上部の培地を取り除きます。
5. 細胞を培養細胞凍結保存用培地に～5x10⁶ cells/mLから1x10⁷ cells/mLの濃度で再懸濁します。ハイブリドーマ細胞の場合には～1x10⁷ cells/mLから1x10⁸ cells/mLの濃度で再懸濁します。バイアル1本ごとに凍結する細胞は1 mLとします。細胞を再懸濁して凍結保存用バイアルに小分けした後には、ドライアイス上で保冷できますが、5分以内には通常の冷凍手順を開始する必要があります。
6. 細胞は最低－80°Cで保存できますが、長期保存の場合には超低温冷凍室（－150°C）または液体窒素（－196°C）中に保存する必要があります。
7. 凍結保存した細胞は以下の手順に従って融解します。
8. 細胞は37°Cのウォーターバスで急速融解します。
9. バイアル1本の細胞は完全増殖培地10mLで希釈します。
10. 細胞を穏やかに増殖培地と混合します。
11. 細胞を穏やかにペレット化し、ペレット上部の培地を取り除きます。
12. 細胞を完全増殖培地に再懸濁し、適切な濃度となるまで希釈し、適切な容器に播種します。