Millicell細胞培養インサートを用いた共培養のプロトコール

A. 第1日

1. T-75フラスコを0.1%ゼラチンDPBS溶液10 mLでコーティングし、37 ℃で30分以上インキュベーションします。
2. PMEFの入ったバイアルを37 ℃のウォーターバスで急速解凍し、暖めた培地10 mLをあらかじめ加えておいた15 mLチューブに内容物を移します。チューブをゆっくりと反転し、4 ℃で1000 rpm以下の回転数として4～5分間遠心して細胞をペレット化します。
3. 上清を取り除いて細胞を再懸濁します。コーティングしたプレート/フラスコからゼラチンを取り出します。以下に示す濃度のフィーダー細胞懸濁液を小分けします。
4. 播種前にフラスコから過剰なゼラチンを除いておきます。
5. フラスコにMEFフィーダー細胞懸濁液を播種します。MEF細胞は1mLあたり約1.5×105細胞としておくと24時間以内に95%のコンフルエンスとなるはずです。
6. 37 ℃で一晩インキュベーションします。

B. 第2日

1. T-75フラスコを、無菌のマイトマイシンC濃度10 μg/mLの培地溶液で処理し、線維芽細胞の活性を抑制します。
2. 37 ℃で2時間インキュベーションします。
3. MEFの培地とマイトマイシンCを除去し、フラスコをあらかじめ暖めておいたDPBS 10 mLで3回洗います。
4. 新鮮な胚性幹細胞（ESC）培地を加え、ESCの播種ができるようになるまで37 ℃でインキュベーションします。
5. 上記のA. 第1日のプロトコールに従って、マウスESCを解凍します。
6. 不活性化したMEFとESC培地を加えたT-75フラスコにESCを1mLあたり約1.5×105の細胞密度で播種します。
7. 37 ℃で一晩インキュベーションします。

C. 第3日

1. MEFフィーダー層のESCに新鮮なESC培地を加えます。

D. 第4～8日

1. MEFフィーダー層のESCに新鮮なESC培地を加えるか、または必要であれば1:2の比率で細胞を継代します。（ESCは解凍後、Millicell-24またはMillicell-96プレートに播種する前に2～3回継代した方がよい結果が得られます。両方の種類の細胞は一緒に立ち上げて、不活性化したMEFを加えた別のT-75フラスコ内で継代します。）

E. 第9日

1. MEFフィーダー層のESCに新鮮なESC培地を加えます。
2. Millicell-24またはMillicell-96のシングルウェルフィーダートレイを、25 μg/mLのフィブロネクチンDPBS溶液約5～10 mLでコーティングし、室温で45分間インキュベーションします。
3. シングルウェルトレイから余分なフィブロネクチンを取り除きます。
4. A. 第1日のプロトコールに従ってMEFを解凍します。
5. フィブロネクチンでコーティングしたシングルウェルトレイにMEF細胞懸濁液を播きます。シングルウェルトレイ1個につきMEF細胞数を約1.67×106とすれば24時間以内に95%コンフルエンスとなります。
6. シングルウェルトレイにフタをして37 ℃で一晩インキュベーションします。

F. 第10日

1. ESCとMEFフィーダー細胞をT-75フラスコから取り上げます。
   a.フラスコをあらかじめ暖めておいたDPBSを10 mL用いて2回洗います（洗うたびに1～2分間インキュベーションします）。
   b. DPBSを取り除き、3 mLのTrypLEを加え、室温で2～3分間インキュベーションします。
   c.倒立顕微鏡で細胞がはがれたかどうかを確認し、ESC培地を加えてTrypLEを不活性化します。
   d.充分に混合し、フラスコをよく洗って細胞を全てフラスコから取り出します。
2. ESCをMEFフィーダー細胞から分離します。
   a. ESC/MEF細胞懸濁液を別のT-75フラスコに入れ、37 ℃で45分間インキュベーションします。
   b. 非接着細胞（ESC）を取り出して別の新たなT-75フラスコにいれ、37 ℃で45分間インキュベーションします。
   c. 再度、非接着細胞（ESC）を取り出し、ESC懸濁液を細胞培養フィルタープレートに播種します。
3. 細胞培養プレートのアピカル側ウェルにESCを播きます。Millicell-96プレートの場合には1ウェルあたり約200～500細胞を100 μLのESC培地に加えて、またMillicell-24プレートの場合には1ウェルあたり約1000～1500細胞を400 μLのESC培地に加えて播種します。
4. MEFを播いたシングルウェルトレイから培地を取り除いた後、約28～32 mLのESC培地を加えます。
5. ESCを播いた細胞培養フィルタープレートとMEFを播いたシングルウェルトレイを組み立てます。
6. 組み立てたら37 ℃で一晩インキュベーションします。

G 第12日および第14日

1. ESCとMEFの間接的共培養にESC培地を加えます。

H. 第16日

1. アルカリホスファターゼ検出キットによりアルカリホスファターゼ活性を分析して、ESCが未分化であることを確認します。