ウェスタンブロット法

タンパク質のブロッティングは 1979年に提唱されて以降 （Towbin et al., 1979）、研究室で日常的に使用されるツールとなっています。タンパク質のブロッティングは、複合サンプルに含まれる少量のタンパク質の検出、あるいはタンパク質の発現および精製のモニタリングに使用されています。ドットブロット法またはスロットブロット法として知られている最も簡単なタンパク質ブロット法は、真空ろ過を用いてタンパク質を微細孔性メンブレン（精密ろ過膜）に転写する方法です。この方法は総タンパク質発現レベルに関する定量データを得ることや、複数サンプルを同時にブロットすることはできますが、タンパク質の分子量に関する十分な情報を得ることができません。また、インタクトなタンパク質とともに、タンパク質分解産物や翻訳後修飾されたアイソフォームが検出される場合があるため、特異性が十分とはいえません。

ウェスタンブロット法は上記の手法より複雑な手法です。タンパク質混合物をゲル電気泳動により分離後、適切なメンブレン（PVDFなど）に電気的に転写します。タンパク質は特異的に標識された抗体または抗原との反応により識別されます。下図「メンブレンを用いた免疫学的検出法」をご参照ください。ウェスタンブロット法は、空間分解能により個々のタンパク質の分子量データを得ることができ、プロセシングの産物からアイソフォームを分離できます。タンパク質を適切なメンブレンに転写後は、染色により可視化することや、N-末端シーケンシング、質量分析または免疫学的検出法により直接同定することができます。

免疫ブロット法は、臨床検査室でも感染症、自己免疫疾患、アレルギーをはじめとする領域に応用されています（Towbin et al., 1989, Stahl et al., 2000）。ウェスタンブロット法は、ウイルス感染期間をとおしてELISAが繰り返し陽性であった場合の信頼性の高い確定診断検査とみなされており、最も高感度、明確かつ簡単で、最も複雑な情報を得ることができる検査系であることが報告されています（Bauer, 2001, Mylonakis et al., 2000, Heermann et al., 1988）。ウェスタンブロット法のアプリケーションの例としては、定量的ウェスタン解析法による酵母におけるタンパク質発現の解析（Ghaemmadami et al., 2003）、タンパク質のコピー数および区画化の測定（Rudolph et al., 1999）、ATPによるプロテインキナーゼ競合阻害の検討（Wang and Thompson, 2001）、作物や食品中の遺伝子組換え生物の検出（Ahmed, 2002）などがあげられます。

また、新たなブロット法およびアプリケーションが開発段階にあります。「ダブルブロット」法（Lasne, 2001, 2003）は、ブロットしたタンパク質と無関係な二次抗体の間の強力な非特異的相互作用により疑陽性を低減する方法です。

免疫学的検出法に影響を及ぼす要因

免疫学的検出法の新たなプロトコールを開発する際には、あらゆる要素とその相互作用を考慮に入れる必要があります。抗体濃度、緩衝液の組成、ブロッキング剤およびインキュベーション時間を実験的に検討し、最適条件を決定する必要があります。水の品質もすべてのステップにおいて重要であり、微量の不純物であっても大きな問題を引き起こすことがあります。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼの酵素活性は、発熱物質（高純度水にも一般に含まれる夾雑物）やアジ化物（抗体溶液に一般的に使用される保存料）により阻害されます。ブロッキング剤の品質も、一貫性および夾雑物について検討する必要があります。

次のセクションには、免疫学的検出法に関する重要な情報を示します。これらの基本概念を理解することは、特定のサンプルに合わせてプロトコールを最適化する際に役立ちます。

緩衝液

最もよく使用されている緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）およびTris-緩衝生理食塩水（TBS）です。これらの緩衝液の組成に関しては多くのバリエーションが発表されています。緩衝液に求められる重要な特性は、抗体の生物活性を損なわないことです。したがって、イオン強度やpHは、生理的条件にきわめて近い必要があります。総リン酸濃度10 mMのPBSは、幅広い抗体および検出基質に適した緩衝液です。

メンブレンを用いた免疫学的検出法

ブロッキング

有意な結果を得るためには、抗体を目的のタンパク質のみに結合させ、メンブレンに結合させないようにする必要があります。抗体の非特異的結合（NSB）は、メンブレン上の未反応部位を不活性タンパク質や非イオン性界面活性剤を用いてブロッキングすることにより低減することができます。ブロッキング剤の条件は、メンブレンに対する親和性が抗体より高いこと、また、メンブレン上のターゲットタンパク質を移動させることなく、メンブレン上の未反応結合部位すべてに結合することです。最もよく使用されているブロッキング剤は、ウシ血清アルブミン（BSA、0.2～5.0%）、脱脂乳、カゼイン、ゼラチンや、界面活性剤Tween®-20の希釈液（0.05～0.1%）です。界面活性剤Tween-20は、抗原を復元する作用を有するため、特異的抗体による認識を向上させることも明らかにされています（Van Dam et al., 1990, Zampieri et al., 2000）。Triton®X-100、SDS、NP-40といったその他の界面活性剤が使用される場合もありますが、作用が強すぎるため、タンパク質間の相互作用を阻害する可能性があります。ブロッキング剤は通常、PBSまたはTBS緩衝液に溶解します。

ブロッキングにはリスクが伴う場合があります。ブロッキング剤の選択が不適切であったり、ブロッキングが過剰であったりすると、目的のタンパク質の移動や不明瞭化が生じるおそれがあります。したがって、正しいブロッキング剤を選択することは、免疫学的検出を成功させる上できわめて重要です。例えば、粉ミルクは糖タンパク質とビオチンの両方を含有するため、ビオチン化抗体やコンカナバリン標識抗体と併用できません。精製されていないタンパク質溶液をブロッキング剤として使用すると、リン酸特異的抗体によるリン酸化タンパク質の解析結果が損なわれるおそれがあります。精製されていないタンパク質溶液はホスファターゼを含有する場合があり、ブロット上のリン酸化タンパク質が脱リン酸化を受ける可能性があります。ブロッキング溶液にホスファターゼ阻害剤を添加することにより、リン酸特異的抗体により検出されるシグナルが増加することが示されています（Sharma and Carew, 2002）。最後に、あるブロッキング剤がある抗原と抗体の組み合わせに適合することが確認されたとしても、別の抗原と抗体の組み合わせに適合するとは限りません。

ブロッキング試薬と検出試薬の間の適合性は、次のスロットブロット法を用いて簡単に決定することができます。メタノールで湿らせ、TBSで平衡化したブランクPVDFメンブレン上にブロッキング溶液をスポットします。ブロットに検出試薬を添加し、5分間インキュベーション後、X線フィルムに露光させます。ダークスポットが現れた場合には、ブロッキング試薬が当該検出試薬と適合しないことを意味します。Immobilon-P^SQトランスファーメンブレンは、Immobilon-Pトランスファーメンブレンと比較して膜内部の表面積が大きく孔径が小さいため、タンパク質結合能がより高いことに留意しておくことが重要です。標準的なウェスタンブロット法に使用するトランスファーメンブレンをImmobilon-PからImmobilon-P^SQにそのまま置き換えた場合には、ブロッキング試薬を使用しても、メンブレン表面を十分飽和できない場合があります。バックグラウンドを低減するため、追加の洗浄ステップを設けなければならない場合があります。ブロッキングは、上記のスポットブロット法を用いて簡便に最適化することができます。

抗体

ブロッキング後、ブロットに1種類以上の抗体を添加しインキュベーションします。一次抗体はターゲットタンパク質に結合し、二次抗体は一次抗体に結合します。二次抗体は、目的のタンパク質の検出に使用する酵素または色素で標識されています。

一次抗体が直接標識されている場合もありますが、二次抗体を使用する明確な利点があります。第一に、二次抗体は1分子の一次抗体に対し複数分子結合できるため、シグナルを増幅することができます。第二に、標識二次抗体（酵素標識抗体）はさまざまな特異性を有する多くの一次抗体に使用できるため、多くの一次抗体を標識する必要がありません。

ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が使用されます。ポリクローナル抗体は通常、抗血清あるいはアフィニティー精製された状態で供給されます。モノクローナル抗体は、腹水または組織培養液中で発現させた後、直接使用する場合もあれば、アフィニティー精製された抗体として使用される場合もあります。変性タンパク質は、未変性抗原に対して作成された抗体には認識されない場合があることに留意することが重要です。非変性ゲルを使用しなければブロットが得られない場合があります。抗体はメンブレンへの非特異的結合を防止するため、緩衝液およびブロッキング溶液で希釈します。抗体希釈液は、抗体の非特異的な凝集を防止するため、Tween-20などの界面活性剤も微量に含有するのが通例です。発表されている化学発光検出法の多くのプロトコールは、ブロッキング溶液および抗体希釈液に0.1%（v/v）Tween-20を添加する必要があるとしています。Tween-20濃度が0.05% （v/v）を超えるとブロットしたタンパク質の一部がメンブレンから洗い流される可能性があることを認識することが重要です。バックグラウンドの低減のため、界面活性剤Tween-20の濃度を上げることがしばしばありますが、より簡単かつコスト効率が良い方法は、抗体、特に二次抗体の濃度を下げることです（下図「二次抗体希釈倍率の最適化」を参照）。

抗体の必要条件としては、目的のタンパク質に特異的であること以外に、ブロッキング用緩衝液の成分と交差反応しないこと、相対的に純度が高いことがあげられます。他のタンパク質または凝集物が混入していると、非特異的結合が生じバックグラウンドが上昇する可能性があります。

免疫学的検出法はきわめて高感度な方法です。高いS/N（シグナルノイズ比）を実現して感度をできる限り高めるためには、一次抗体および二次抗体の濃度を個別に最適化する必要があります。通常、非特異的シグナルは一次抗体の希釈倍率を上げるか、ゲルにロードするタンパク質量を減らすことにより低減できます。バックグラウンドが全体的に高い場合には、酵素標識二次抗体の希釈倍率を上げることにより低減できます。

一次抗体および二次抗体の最適濃度はいずれも、検出試薬の感度にも依存します。高感度試薬（フェムトグラムレベルで検出）を使用する場合の抗体量は、低感度試薬（ピコグラムレベルで検出）を使用する場合と比較して1/20まで減らす必要があります。

洗浄

ブロットの洗浄は、高いバックグラウンドと不十分な検出をもたらす可能性のある非結合抗体をメンブレンから除去します。特に抗体調製物の精製度が比較的低い場合や、高濃度で使用する場合には、Tween-20のPBSまたはTBS緩衝液による希釈液（0.05% v/v）がよく使用されます。前記のように、界面活性剤の濃度をこれより上げると、メンブレンから目的のタンパク質が溶離する可能性があります。精製度が高い抗体を使用する場合には、緩衝液のみで十分洗浄できることが少なくありません。

必要な洗浄回数は、実験により決定するのが最善です。洗浄が不十分であると、バックグラウンドが高くなります。一方、過度の洗浄は抗体の溶離によりシグナルを低下させる可能性があります。1回5分の洗浄を3回以上行うことをお勧めします。

頑固なバックグラウンドは、TBS洗浄用緩衝液に塩化ナトリウムおよびSDSをそれぞれ最高0.5Mおよび0.2%まで添加したり、洗浄時間を2時間まで延長することにより低減できます。

Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrateを用いたERK 1の免疫学的検出に使用する二次抗体希釈倍率の最適化。ラット肝溶解液サンプルの2倍希釈液を各ゲルに添加しました。電気的にブロッティングしたタンパク質を、ウサギ抗ERK 1抗体（1:1,000希釈）およびHRP-標識ヤギ抗ウサギ IgG （左から順に1:5,000、1:20,000および1:100,000希釈）でプローブしました。

ダブルブロット

ウェスタンブロット法における非特異的結合を抑えるための革新的方法が、Laboratoire National de Depistage du Dopage （ドーピング検査機関、シャトネー-マラブリ、フランス）のDr. Francoise Lasneにより開発されました（Lasne, 2001, Lasne, 2003）。Dr. Lasneは、組換えヒトエリスロポエチン（EPO）の検出に取り組んでいます。同氏は、組換えEPOと天然EPOの等電点（pI）が異なることを発見しました。組換えEPOのpIは4.42～5.11である一方、天然EPOの等電点はこれより酸性側にあります（3.92～4.42）。しかし、尿検体をブロットする場合には、二次抗体の非特異的結合（NSB）がきわめて高いため、組換えEPOと天然EPOの識別が困難です。Dr. LasneはNSBを低減するため、「ダブルブロット」という革新的な溶液を開発しました。ブロットしたタンパク質に一次抗体を結合させた後、酸性条件下で抗体を2枚目のImmobilon-Pメンブレンに転写します。一次抗体は抗原から脱離し、中間体を介して2枚目の（ダブルブロット）メンブレンに転写されます。ダブルブロットメンブレンを二次抗体でプローブする際、非特異的に結合する他のタンパク質が存在しないため、バックグラウンドを低減できます。

「ダブルブロット」は、トランスサイレチンの検出にも使用されており、他の低濃度の血清中タンパク質または尿中タンパク質の検出に有用な方法と考えられます。

検出試薬（基質）

近年の免疫学的検出法には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ（AP）などの酵素を共有結合させた二次抗体を用いる酵素免疫測定法が使用されています。標識酵素が特異的基質の分解を触媒することにより、シグナルが発生します。3タイプの基質（発色基質、化学発光基質および化学蛍光基質）のほか、蛍光プローブ標識された二次抗体も一般的に使用されています。Immobilon PVDFメンブレンは、市販されているすべての発色基質および化学発光基質との適合性が検討済みです。

発色検出法

下図の発色検出には、有色の不溶性沈殿物を生成する反応を触媒する酵素が使用されます。例えば、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドール-リン酸（BCIP）と4-ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（NBT）の相互作用により、青色の不溶性化合物が生成します（Leary et al., 1983）。この手法は実施が容易で、解析に特別な装置を必要としませんが、次の点に留意する必要があります。

• 発色検出法の感度は、化学発色試薬を用いた場合の検出感度より10倍以上低いのが通例です。
• 沈殿物が生成すると、酵素活性が阻害され、感度が低下する可能性があります。
• 沈殿物をメンブレンから除去することが難しいため、他のタンパク質の検出へのブロットの再利用が制限されます。

化学発光検出法

化学発光検出法には、可視光の発生に至る反応を触媒する酵素が使用されます。化学発光システムは、ホースラディッシュペルオキシダーゼによる過酸化物の生成を原理とする場合や、基質として1,2-ジオキセタン、酵素としてアルカリホスファターゼを使用する場合があります（Cortese, 2002）。化学発光検出法は、発色検出法と同等に迅速かつ安全で、放射性同位元素による検出法と同等の感度を有します。検出には、ブロットをX線フィルムに露光させる方法や、化学発光に対応するデジタル画像システム（通常は、電子的ノイズを抑えるため、高感度冷却CCDカメラを装備したシステム）を用いて直接撮影する方法が用いられます。化学発光基質を用いた場合には、リプローブが可能です。

研究には、検出感度が異なるさまざまな化学発光基質が利用されています。従来の基質、すなわち低感度の基質は、ピコグラムレベルのタンパク質を検出することができます。このような基質はルーチンのアプリケーションには適しているものと考えられますが、微量のタンパク質を検出できません。Immobilon基質などの新たな高感度基質は、フェムトグラムレベルのタンパク質を可視化することができます。しかし、このように強力な基質を使用する場合には、しばしば一次および二次抗体濃度を最適化する必要があります。

低感度基質をImmobilon Western HRP基質などの高感度基質に切り替える場合には、抗体の希釈倍率を上げ、過度のバックグラウンドおよび非特異的バンドの出現を防止することが推奨されます。

発色基質BCIP/NBT（KPL）を用いたヒト血清中トランスフェリンの免疫学的検出

左から順にヒト血清1:1,000、1:5,000、1:25,000、1:125,000希釈液5 μLをロードしました。電気的にブロッティングしたタンパク質をヤギ抗ヒトトランスフェリン（1:10,000希釈液）とAP-標識ウサギ抗ヤギIgG（1:30,000希釈液）でプローブしました。

蛍光検出法

蛍光検出法には、蛍光プローブ標識抗体、あるいは酵素活性部位で蛍光を発する蛍光基質（化学蛍光基質）が使用されます。蛍光検出法の長所のひとつは、蛍光シグナルが長時間安定であるため、ブロットの保存や再撮影を行うことができることです。また、幅広い蛍光プローブが存在するため、単一サンプル中の複数のターゲットタンパク質を同時に検出することができます（マルチカラー検出）。

ほとんどのブロットメンブレンは高い蛍光バックグランドを有するため、最近まで、ウェスタンブロット法の蛍光検出には限界がありました。ミリポアのImmobilon-FLトランスファーメンブレンは、従来のブロットメンブレンと比較して、広範囲の励起/蛍光波長にわたり低い蛍光バックグラウンドを示します（下図「様々なメンブレンにおける蛍光検出」を参照）。Immobilon-FLトランスファーメンブレンは、蛍光による免疫学的検出法を用いるあらゆるアプリケーション（化学蛍光基質によるマルチカラー検出を含む）に最適です（下図「蛍光による免疫学的検出法の例」を参照）。また、Immobilon-FLメンブレンは、標準的な化学発光法または発色法による検出にも使用できます。

Immobilon PVDFトランスファーメンブレンのリプローブ

1枚のブロットは、最初の抗体をブロットから除去し、別の抗体とインキュベーションすることにより、複数の抗体を用いて解析することができます。この点は、タンパク質の共存を実験する場合や、方法を最適化する場合、あるいは検体量が限られている場合に特に有用です。「メンブレンからの抗体除去プロトコール」セクションをご覧ください。

抗体除去ステップは、抗原抗体結合を切断し、抗体を周囲の緩衝液中に遊離させます。抗体の除去は界面活性剤処理と、熱または低pH処理の併用により行われるのが通例です。いずれの方法を用いても、発色検出系で生成した有色の沈殿物（BCIP、4CN、DAB、TMBなど）を除去することはできません。しかし、異なるターゲットタンパク質に対する特異的抗体を用いてブロットを解析することはできます。