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神経幹細胞研究用細胞

ReNcell不死化前駆細胞および血清非含有培地

• 不死化ヒト神経前駆細胞の使用に便利です
• 不死化細胞は核型を安定に維持したまま無限に複製します
• ReNcell Neural Progenitorsは限定的多能性（multi-potent）です。3種類の神経細胞系統 （ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト）全部に分化することが示されています。
• 血清非含有の特許取得完全培地 ReNcell Mediaを用いて増幅が容易にできます

ヒト神経幹細胞

ReNcell VMはヒト胎児組織の腹側中脳領域から、また ReNcell CXはヒト胎児組織の脳皮質領域から樹立されたヒト神経幹細胞株です *。転写因子 mycの導入により不死化されており、遺伝子型と表現型を安定に維持したまま増殖を続けます。ReNcellは容易に入手できる初めてのヒト胎児神経前駆細胞です。長期間培養しても増殖し（45継代以上）、自己複製能があり、また 3種類の神経細胞種のいずれにも分化することが証明されています。

In vitroにおける限定的多能性 （multipotent）細胞の分化

ReNcellは容易に未分化状態に維持することができ、典型的な未分化細胞の形態である「敷石状」の形状を示します。複数の細胞系統への分化が簡単かつ柔軟にできるので、これらの細胞は、幹細胞の基礎的生物学や神経科学および応用 CNS薬物創薬分野の幅広いアプリケーションで有用なツールとなっています。VM細胞は in vitroで高レベルのヒトドーパミン作動性ニューロンに分化することが示されており、電気生理学的作用性も示されています。ReNcell CXはニューロンやグリア細胞に分化しやすくなっています。

安定な正常二倍体細胞

myc癌遺伝子により ReNcellsは培養中では正常状態と「幹細胞としての特性」が維持されていると考えられます。ReNcellsは増殖因子の存在下では、増殖速度、核型、表現型および限定的多能性を、神経細胞に特異的な表現型も含めて、長期継代にわたり安定に維持することが示されています。増殖因子を除去すると、完全に発達したニューロンへと急速に分化します。

血清非含有の特許取得完全培地

最適化された ReNcell Maintenance Mediaおよび ReNcell Freezing Mediaは培養ごとの偏差要因をなくして ReNcell培養を成功に導くための、血清非含有の最適な環境を提供します。

*ReNcellsは、インフォームドコンセントを得る各地域の手順に従い、合法的かつ倫理的な方法で単離されています。

NEW ENStem-A™: Human Embryonic-derived Neural Progenitors and Optimized Media 〔海外情報〕

ENStem-A Human Neural Progenitor Cells are derived from NIH approved WA09 human embryonic stem cells (hESCs). They proliferate as an adherent cell monolayer, maintain karyotype stability up to 10 passages and can readily differentiate into different neuronal subtypes. ENStem-A human neural progenitor cells may be used for a variety of research applications such as studies of neurotoxicity, neurogenesis, electrophysiology, neurotransmitter and receptor functions. ENStem-A cells are provided cryopreserved in a kit with 500 mls of Specially optimized Expansion Media containing FGF. Also available separately are Expansion Medium, Neuronal Differentiation Medium and Freezing Medium .

マウス/ラットの Neural Stem Cell

Neural Stem Cell細胞株には、ラット初代海馬ニューロンおよびアストロサイト、Fisher 344系ラット成体海馬から単離した初代神経幹細胞、および C57/BL6系マウス第 15～18日齢胚 （E15～E18）の大脳皮質および脊髄から単離したマウス神経幹細胞が、ready-to-useの （前処理の不要な）状態で含まれています。この初代細胞はどのロットも適切なマーカーの高度の発現性について検証済みであり、成体ラット NSCについては、自己複製能および複数の細胞系統への分化能についても検証済みです。

ラット成体海馬由来神経幹細胞 （カタログ番号 SCR022）を培養し、（A） Nestin （赤色）および （B） Sox-2 （赤色）で染色しました。Sox-2転写因子は、核の DAPI （青色）染色と共局在化が認められました。 （C）ラット成体海馬由来神経幹細胞（カタログ番号 SCR022）を 4日間分化条件で培養後、マウス抗-Oligodendrocyte O1（緑色）で染色しました。（ D）10日間培養した Primary Rat Hippocampus-derived Embryonic Neurons （カタログ番号 SCR009および SCR010）のMAP-2 （オレンジ色）の局在化。

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Neural Stem Cell Characterization Kits

Neural Stem Cell Characterization Kit （カタログ番号SCR019）は、研究者が抗体パネルを用いて神経幹細胞の表現型を解析する際に便利なツールとなります。このキットには NSCマーカーの Nestinおよび Sox-2が含まれており、また成体神経細胞マーカーも、ニューロン（Map2ab）、アストロサイト （GFAP）およびオリゴデンドロサイトOligodendrocyte）判定用に含まれています。さらに、バックグラウンド染色評価用にマウスおよびウサギの免疫グロブリンも含まれています。

Neuron-Glial Marker Sampler Kitに入っている抗体は、ニューロン （β-tubulinおよび Map2ab）、アストロサイト （GFAP）およびオリゴデンドロサイト （RIP）判定用です。 ESC Derived Neuron Integration & Characterization Kitは、成熟した中枢神経系 （CNS）組織への ES細胞由来ニューロン統合の局在化、特性判定および解析を幅広く対象とした新しいキットです。このキットにより、成熟した神経の薬理学的サブタイプの分類および移植細胞も含めて興奮性シナプスと抑制性シナプスの判別および定量化が可能となります。

Adult Rat Hippocampal NSCs （カタログ番号 SCR021, SCR022）は限定的多能性 （multipotent）幹細胞です。NSCsをアストロサイト分化用培地 （A-C）またはニューロンおよびオリゴデンドロサイト分化用培地 （D-F）のいずれかで分化させました。 （B）LIF、BMP4およびウシ胎児血清を含む Astrocyte Differentiation Medium （カタログ番号 SCM010）において 9日間の培養後には、ほとんどの細胞がアストロサイト表現型を呈していることが （GFAP検出では 85%）、アストロサイト特異的マーカーである GFAPに対する陽性の免疫応答性により確認されました （Cの赤色部分）。 （E） NSCsをレチノン酸およびフォルスコリン存在下（カタログ番号 SCR035）で 5日間培養したところ、ニューロン （β-tubulinでは 70%の検出率、Dの赤色）およびオリゴデンドロサイト （O1検出では 30%、Fの緑色）に優先的に分化しています。この培養条件では GFAP陽性のアストロサイトは認められませんでした。細胞の核は DAPIで可視化されました （青色）。

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Rat Hippocampal Neural Stem Cell Kit

Rat Hippocampal Neural Stem Cell Kit （カタログ番号 SCR021）は ready-to-useの （前処理の不要な） Fisher 344系ラット成体海馬から単離した初代神経幹細胞が含まれています。また、神経幹/前駆細胞の免疫細胞化学染色用抗体 （Nestinおよび Sox 2）および分化後の神経細胞 （ニューロン用 MAP-2およびアストロサイト用 GFAP）も含まれており、NSCsおよびその分化後の子孫細胞の培養と分析に有用です。凍結保存生存 Rat Hippocampal Neural Stem Cellsは別売りでもお求めいただけます。

ラット海馬アストロサイトキットを用いて得られた染色結果。ウサギ抗 GFAP抗体 （赤色）およびマウス抗 Map2ab抗体 （緑色）により染色した初代アストロサイトの免疫蛍光染色像を示します。 Map2ab染色は認められないことからわかるようにニューロンは検出されませんでした。細胞核は DAPI （青色、キットには含まれていません）により可視化されました。

Rat Hippocampal Astrocyte & Neuron Kits

Neural Stem Cell Expansion Kits

Neural Stem Cell Expansion Kitsは、神経幹細胞およびその分化後の子孫細胞の培養と解析用のマルチコンポーネントシステムです。これらのキットには初代神経幹細胞、神経幹細胞増幅用培地、および神経幹/前駆細胞の免疫細胞化学染色用抗体 （Nestinおよび Sox2）と分化後の神経表現型検出用抗体（ニューロン用 Map2ab、アストロサイト用 GFAPおよびオリゴデンドロサイト用 O1）の抗体パネルも含まれています。
Mouse Cortical Neural Stem Cell Expansion Kit （カタログ番号 SCR032）には、C57/BL6系マウス第 15 ～18日齢胚 （E15～E18）から単離したマウス大脳皮質神経幹細胞が含まれています。また Mouse Spinal Cord Neural Stem Cell Expansion Kit （カタログ番号 SCR033）には、C57/BL6系マウス第 15～18日齢胚 （E15～E18）から単離した脊髄由来の初代神経幹細胞が含まれています。Adult Rat Neural Stem Cell Expansion Kit （カタログ番号 SCR034）には、Fisher 344系ラット成体海馬から単離した初代神経幹細胞が含まれています。

Rat Neural Stem Cell Blotting Kit

Rat Neural Stem Cell Blotting Kitは、神経幹細胞の維持と分化に関連する細胞シグナリング分子やタンパク質の発現のモニタリングに役立つバイオツールです。各キットには、神経幹細胞およびその分化後の子孫細胞であるニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトから得られた正常化済み細胞抽出物を加えた二つのタンパク質ブロットが含まれています。細胞性サンプル全体のタンパク質正常化の程度を評価するために、アクチン抗体が含まれています。さらに神経幹細胞およびアストロサイトの有無の判別にルーチン的に用いられる 2種類の神経特異的抗体 （NSC用の Nestinおよびアストロサイト用の GFAP）も含まれています。さらに ReBlot Plus Kitも含まれているため、タンパク質ブロットを何回も再利用しやすくなっており、高い付加価値があります。

Rodent Neuron Differentiation Kit

Neuron Differentiation Kitは、血清非含有の完全培地に加えてげっ歯類神経幹細胞を培養すると神経細胞系統に優先的に分化を誘導する神経誘導因子が 2種類含まれています。このキットはまた、分化後のニューロン集団の免疫組織化学的特性判定用の抗体も含んでいます。マウス大脳皮質および脊髄の各神経幹細胞やラット海馬神経幹細胞で大規模な有用性検証がおこなわれています。Neuron Differentiation Kitを利用すると比較的純粋なニューロン集団が得られます （β III-tubulin陽性率は最高 70%）。アストロサイトは極めて低いレベルで検出されました （< 0.5%）。

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神経幹細胞研究用培地

Astrocyte Differentiation Medium （カタログ番号 SCM010）で 6～ 9日間分化したラット成体海馬神経幹細胞（カタログ番号 SCR022）。GFAP陽性細胞は 90%以上の高率で検出され、 Map2陽性のニューロンは 1%未満および O1陽性のオリゴデンドロサイトは 5%未満と低い検出率となりました。

Neural Stem Cell Basal Medium （カタログ番号
SCM003）は血清非含有および増殖因子非含有の完全培地です。げっ歯類由来の神経幹細胞の増殖および in vitro分化用に最適化されています。この基本培地は bFGFまたは bFGF、EGFおよびヘパリンと組み合わせて使用することにより、前者の組み合わせではラットの、後者の組み合わせではマウスの神経幹細胞の増殖が可能となります。Neural Stem Cell Basal Mediumから増殖因子を除去することで、げっ歯類神経幹細胞の偶発的分化を導くことができます。 Mouse Neural Stem Cell Expansion Medium （カタログ番号 SCM008）および Rat Neural Stem Cell Expansion Medium （カタログ番号 SCM009）は、2コンポーネントシステムとして提供されており、便利で簡単に利用できます。これらの増幅キットには Neural Stem Cell Basal Mediumと必要な補足添加物が含まれており、組み合わせて利用すればマウスやラットの神経幹細胞の増殖や増幅ができます。

増殖因子 hLIFを bFGFならびに EGFと共に用いて遊離のヒト神経幹細胞 （細胞塊）を in vitro培養しました （倍率は 20倍）。左は播種時、右側は 7 ～ 14日経過後を示します。hLIFの添加により長期の増幅速度が向上し、分化後には生じたニューロン数が増加しています。写真は StemCells, Inc.の善意により提供されています。

Astrocyte Differentiation Medium

神経幹細胞増殖因子

NSCsを遊離の浮遊細胞塊（neurospheres）として培養する条件は、分化後に生じるニューロンの数に影響してきます。ヒトEGF応答性神経塊に由来するニューロン数は、特殊な培養条件を用いると増加することが示されています。その場合使用されたのは、増殖因子カクテルおよび分化段階における細胞間接触でした（Carpenter, 1999, Experimental Neurology）。このような条件により、産生ニューロン数が増加し（8%から60%以上）、また最も影響が顕著であったのは、Neurotrophic Factors（神経栄養因子）3および4（NT3およびNT4）ならびにPlatelet-Derived Growth Factor（血小板由来増殖因子）（PDGF）を添加した場合でした。さらにCiliary Neurotrophic Factor（毛様体神経栄養因子）（CNTF）では、対照では20%であったアストロサイト誘導数が42%まで増加しました。ミリポアの包括的な幅広い種類のサイトカインは、NSC増幅用の培養条件の検討および分化に影響する因子の研究を進める上で有用です。

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神経幹細胞および分化後の子孫細胞のマーカー

神経幹細胞マーカー

ミリポアは利用可能な神経マーカーとしては最大のシリーズを提供しています。下記に興味深い多くのマーカー類リストを示します。利用可能な全マーカーのリストはwww.millipore.com/nihonでご覧ください。未分化のNeural Stem Cells（神経幹細胞）（NSCs）は従来、中間径フィラメントであるNestinの発現によって決定されており、成熟神経細胞マーカー発現がありません。これらのマーカーの他にも、その他多くの抗原がNSCsの特性判定には用いられてきています。細胞表面抗原に対する抗体パネルを用いて、フローサイトメトリによりクローン性増殖能を有するNSCsがヒト胎児脳組織から単離されました（Uchida, 2000,PNAS）。純粋化したNSCsはCD133⁺、CD34^－、CD45^－およびCD24^－/loの各細胞として判別され、免疫欠損新生児マウスの脳に生着可能でした。また別の研究では、死後剖検のヒト脳皮質から単離されたヒト神経前駆細胞は、CD24（HSA）、CD44（Pgp-1）、CD81、CD90（Thy-1）、CD133およびCD184などの胎児前駆細胞培養細胞とすでに関連付けられている数々のマーカーを表現していることが認められました。（Schwartz, 2003, J. Neuro. Res.）

同様に、数々の抗原はマウスNSCsの判別に有用であると想定されています。Prominin-1（CD133、AC133抗原のヒトオルソログ）に対するモノクローナル抗体を用いて、このタンパク質は発生中のマウス中脳の脳室表面において発現されることが示され、Prominin-1はマウス神経前駆細胞の細胞表面マーカーとして利用できる可能性が示唆されています（Sawamoto, 2001, J. Neurosci.）。別の方法により、マウスNSCsは80%の純度で単離されています。この場合はNestinなどのNSCマーカーの独自のFACS特性、CD24（Heat Stable Antigen）の低レベルの発現およびPeanut Agglutinin（ピーナツアグルチニン）結合性にもとづいて単離されました（Cai, 2004, J. Neurochemistry）。さらに、糖鎖抗原SSEA-1に対するモノクローナル抗体を用いたFACSにより、脳室下帯から純粋なマウス成体NSCs集団が単離されました（Capela, 2002, Neuron）。

Neural Stem Cell Markers

BCRP1	CD184 [C-X-X] CHEMOKINE RECEPTOR
CD24 [HEAT STABLE ANTIGEN]	NESTIN
CD34, CLASS I	NUCLEOSTEMIN
CD34, CLASS II	POLYSIALIC ACID-NCAM [PSA-NCAM]
CD34, CLASS iii	PROMININ-1 [CD133]
CD44S	SDNSF [NEURAL STEM CELL DERIVED NEURONAL SURVIVAL PROTEIN]
CD45 [LCA]	SOX-2
CD81 [TAPA-1	STAGE-SPECIFIC EMBRYONIC ANTIGEN-1 [SSEA-1]
CD90 [THY-1]

神経幹細胞分化解析

Neuronal Markers

Astrocyte Markers

Oligodendrocyte Markers

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