ELISAのプロトコール

ELISA フローチャート－酵素免疫測定法

サンドイッチELISA法

1.	アッセイの前に、両方の抗体調製物を精製し、一方を標識しておきます。
2.	ほとんどのアプリケーションでは、ポリ塩化ビニル（PVC）製のマイクロタイタープレートが最適です。ただしタンパク質結合に最も適した種類のプレートの選択については、メーカーのガイドラインを参考にしてください。
3.	標識化していない方の抗体溶液を約50 μLずつウェルに加えて（PBS中濃度20 μg/mL）、抗体をウェルの底に結合させます。PVCの場合には1ウェルあたりにおよそ100 ng（300 ng/cm²）が結合します。用いる抗体の量はアッセイごとに異なりますが、最大限に結合させたい場合には1ウェルあたり1 μg以上とします。これはウェルの容量をはるかに超えていますが、結合がより迅速におこなわれ、また結合用の溶液を保存して再利用することができます。
4.	プレートを4℃で一晩インキュベーションして完全に結合させます。
5.	ウェルをPBSで2回洗います。500 mLの洗ビンが便利です。抗体を洗った後の液は、プレートを適切な容器の上で軽く振れば除去できます。
6.	マイクロタイタープレートのタンパク質を結合させた部分以外の部位を、ブロッキング用緩衝液を加えて飽和させておく必要があります。ウェルの上端まで、アジ化ナトリウム（0.02%）を加えた3%BSA/PBSを満たします。室温において高湿条件で2時間から一晩かけてインキュベーションします。注記：アジ化ナトリウムはホースラディッシュペルオキシダーゼ阻害剤です。HRP標識化抗体を検出に用いる場合には、アジ化ナトリウムを緩衝液や洗浄溶液には加えないでください。

7.	ウェルをPBSで2回洗います。
8.	抗原溶液50 μLをウェルに加えます（この抗原溶液は力価を測定しておく必要があります）。希釈はすべてブロッキング用緩衝液（3% BSA/PBS）を用います。室温において高湿条件で2時間以上インキュベーションします。
9.	プレートをPBSで4回洗います。
10.	標識化した二次抗体を加えます。加える量は予備試験をして決定しておきます。正確な定量とするには、二次抗体は過剰量を使う必要があります。希釈をする場合には必ずブロッキング用緩衝液を使用します。
11.	室温において高湿条件で2時間以上インキュベーションします。
12.	PBSを何回か交換しながら洗います。
13.	メーカーの指示に従って基質を加えます。指示されているインキュベーション時間が経過したら、ELISAプレートリーダで目的波長における光学密度を測定できます。注記：酵素基質には、発がん性の疑いがあるために有害であると考えられるものもあります。注意して取り扱うようにし、取り扱い上の適切な注意事項については製品安全データシートを参照してください。

定量的な測定をする場合には、未知サンプルのシグナルを標準曲線シグナルと比較します。正確を期すためには、アッセイごとに標準品をサンプルと同時に試験する必要があります。

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競合ELISA法

ほとんどのアプリケーションでは、ポリ塩化ビニル（PVC）製のマイクロタイタープレートが最適です。ただしメーカー側のガイドラインを参照して、タンパク質結合に最も適したプレートを選択してください。

希釈した一次抗体（捕捉抗体）50 μLを各ウェルに加えます。サンプルを試験する前に、チェッカーボードで力価を用いて適切な希釈率を決定しておく必要があります。PVCは1ウェルあたりにおよそ100 ng（300 ng/cm²）を結合します。使用する抗体の量はアッセイごとに異なってきますが、最大限に結合させるには1ウェルあたり1 μg以上とします。これはウェルの容量をはるかに超えていますが、結合がより急速におこなわれ、また結合用の溶液を保存して再利用することができます。室温で4時間、または4℃で一晩インキュベーションします。
注記：精製した捕捉抗体が利用できない場合には、以下の手順に従って、捕捉抗体のホストに直接結合させる精製した二次抗体であらかじめプレートをコーティングする必要があります。

未標識の二次抗体溶液を約50 μLずつ各ウェルに加えて（PBS中濃度20 μg/mL）二次抗体をウェルの底に結合させます。
プレートを4℃で一晩インキュベーションして完全に結合させます。
一次捕捉抗体を加えます（上記参照）。

3.	ウェルをPBSで2回洗います。500 mLの洗ビンが便利です。抗体を洗った後の液は、プレートを適切な容器の上で軽く振れば除去できます。
4.	マイクロタイタープレートのタンパク質を結合させた部分以外の部位を、ブロッキング用緩衝液を加えて飽和させておく必要があります。ウェルの上端まで、アジ化ナトリウム（0.02%）を加えた3% BSA/PBSを満たします。室温において高湿条件で2時間から一晩かけてインキュベーションします。
5.	ウェルをPBSで2回洗います。
6.	標準品またはサンプル溶液50 μLをウェルに加えます。希釈はすべてブロッキング用緩衝液（Tween-20を0.05%加えた3% BSA/PBS）を用います。注記：ナトリウムアジドはホースラディッシュペルオキシダーゼ阻害剤です。HRP-標識化複合体を検出に用いる場合には、アジ化ナトリウムを緩衝液や洗浄溶液には加えないでください。

7.	抗原複合体の溶液50 μLをウェルに加えます（この抗原溶液は力価を測定しておく必要があります）。希釈はすべてブロッキング用緩衝液（Tween-20を0.05%加えた3% SA/PBS）を用います。室温において高湿条件で2時間以上インキュベーションします。
8.	プレートをPBSで4回洗います。
9.	メーカーの指示に従って基質を加えます。指示されているインキュベーション時間が経過したら、ELISAリーダーで目的波長における光学密度を測定できます。注記：競合ELISA法からは反比例曲線グラフが得られます。この場合、サンプルや標準品中の抗原力価が高いほど、色の変化は少なくなります。

ELISA Diagram


ステップ1 分析対象に特異的な一次捕捉抗体をプレートに加えウェル壁に結合させます。	ステップ2 標準品、抗原およびコントロール物質を加えてインキュベーションします。吸引除去して洗い流します。	ステップ3 ビオチン化した二次（検出）抗体を加えます。コーティングした抗体-分析対象-検出抗体の「サンドイッチ状」複合体が形成されます。吸引除去して洗い流します。

ステップ4 ストレプトアビジン標識化酵素を加えます。これがビオチン化した検出抗体に結合します。吸引除去して洗い流します。	ステップ5 基質を加えてインキュベーションします。基質は結合した分析対象の量に比例して青色に変化します。	ステップ6 反応停止液を加えて読み取ります。これによって反応が停止し青い色の液が黄色に変化します。色の変化を測定します。