フローサイトメトリーのプロトコール

フローサイトメトリーのフローチャート

フローサイトメトリー用の直接染色プロトコール

注記：以下のプロトコールは、実験アッセイ別のプロトコールを構築する際にテンプレートとして使用できる一般手順を示すものです。フローサイトメトリー施設または技術者と連携し、実験系にふさわしい手順を詳細に構築することを強くお勧めします。

必要な材料

Ca2+、Mg2+、1% BSA または2% FCS 含有PBS に懸濁し、細胞数を測定した細胞（約0.5 ～ 1 ×106/mL）
対象とする細胞表面マーカーに対する直接標識モノクローナル抗体
洗浄液（Ca2+ 非含有、Mg2+ 非含有、1% BSA 含有または非含有1X Dulbecco's PBS）
任意の固定液： 1% ホルムアルデヒド-PBS pH 7.4（新たに調製）

プロトコール

1.	12×75 mmポリプロピレンまたはポリスチレンチューブ3本に、細胞を50～100 μLずつ分注します。注記：チューブ1本あたりの分注量50 μLが約10⁵細胞に相当するよう、採取した細胞の濃度を最初に約0.75×10⁶細胞/mLに調整しておきます。

2.	1本目のチューブに、適切な量（通常5～10 μL）の蛍光色素標識モノクローナル抗体を添加します。2本目のチューブには、アイソタイプが一致するコントロール抗体を同量添加します。アイソタイプコントロール抗体は、対象抗原に対する標識抗体とアイソタイプを一致させます。最後の細胞チューブには、標識抗体と同量の1X PBSを添加します。このチューブは、フローサイトメーターの適切な電気的条件を設定するため、自己蛍光コントロールとして使用します。各サンプルチューブを低速でボルテックスします。
3.	サンプルを暗所、室温または4 ℃で20～30分間インキュベーションします。
4.	チューブ内の細胞を3 mLの1% BSA含有1X PBSで洗浄し、サンプルを400 xg、室温で10分間遠心します。上清を慎重にデカントするかピペットで吸引します。このステップを必要に応じて繰り返します。
5.	直ちに使用する場合には、固定処理を行わなくても細胞を解析できます。その場合には、細胞ペレットをPBS洗浄液500 μLに再懸濁し、使用するまで暗所、4 ℃で保存ください（通常4時間以内に使用）。直ちに使用しない場合には、細胞ペレットをボルテックスにより崩し、残った洗浄液に再懸濁します。1%ホルムアルデヒド-PBS 500 μLを各サンプルに添加し、速やかに再度混合します。固定液を添加する前に細胞ペレットを混合しておくことが重要です。細胞ペレットを混合しておかないと、細胞がフローサイトメーターを通過できない固体塊の状態で固定されます。固定したサンプルは、FACS解析を実施するまで、暗所、4 ℃で保存できます。固定したサンプルは48時間以内に使用してください。

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