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IHC Select Detection Systems


ミリポアの高品質のIHC Select® Detection Systemは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織を最高品質に染色します。このキットは、IHCに使用できることが検証済みのあらゆる抗体とともに使用できるよう設計されており、IHC研究に必要な試薬がすべて含まれています。プロトコールが標準化され、試薬があらかじめ希釈されていますので、1時間未満の所要時間で再現性の高い高品質の染色が実現します。

西洋ワサビペルオキシダーゼ/DABまたはアルカリホスファターゼ/Fast Redを用いた検出が可能です。IHC Select® Reagentは、キット一式としても試薬ごとでも購入できます。

迅速な結果
  • 1時間未満で優れた品質の染色が実現します。
最適化された試薬
  • 高いシグナルノイズ比
  • 一貫した結果
使いやすさ
  • 色分けされた試薬
  • 簡単なプロトコール
柔軟

手動システムにも自動システムにも最適

IHC Select®

Detection Kit一式には次のものが含まれています：

  • 20X Rinse Buffer
  • Blocking Reagent
  • Biotinylated Secondary Antibodies
  • Streptavidin-Enzyme Conjugate
  • Chromogen（A およびB コンポーネント）
  • Hematoxylin
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IHC Select® Manual Staining System

ChemiconのIHC Select® Manual Staining Systemの目的は、顕微鏡用スライド 2～40枚のIHC染色を同時に行うことです。顕微鏡用スライドはスライドホルダー1個に収容され、IHC手順を通して同時に移動します。このため、技術者の時間が節約できるほか、効率および再現性を最大限に高めることができます。本システムはIHCを簡単に実施することができるため、IHC実験に要する時間と技術者のストレスが低減されます。

システムの内容
  • Slide Holder ：黒色アルミニウム製のSlide Holderは、顕微鏡用スライド2 ～ 40 枚を固定する外枠で構成されます。Slide Holder はBase Platform に沿って手動で移動するため、顕微鏡用スライドをReagent Tray に浸すことや、Wicking Pad 上に静置することができます。簡単なIHC 手順では、Slide Holder をReagent Tray ・Wicking Pad 間で反復移動させます。
  • Base Platform ： 黒色アルミニウム製のBasePlatform は、Nest を適正な位置に固定します。
  • Nest ：透明アルミニウム製のNest は、SlideHolder、Reagent Tray およびWicking Pad を正しい位置にセットするため、Base Platform 上に配置されます。
  • Reagent Tray ： Reagent Tray は、各種IHC 試薬をそれぞれ分けて収容します。顕微鏡用スライドにのせた組織は、特定のIHC 試薬中でインキュベーション後、Wicking Pad に移動させます。
  • Wicking Pads ：高吸水性のWicking Pad は、顕微鏡用スライド上の組織のインキュベーションに使用し終わった試薬を吸収します。
  • Capillary Gap Slide、Tissue Location ：これらの特別なCapillary Gap Slide は、片面のフロストラベル部分（および「終足（end feet）」）に塗装が施されています。組織はこちらの面にのせます。Capillary Gap スライド2 枚のラベル面同士を（向かい合わせに）重ねると、塗装面が組織同士を隔て、ギャップを生み出します。スライドの下部を液体（緩衝液、一次抗体など）に浸すと、液体が毛管現象によりスライドグラスの間を静かに上昇し、組織を被います。スライドの下部をWicking Pad 上に静置すると、液体がWicking Pad へと排出されます。スライドはプラスに帯電しており、ガラス表面への組織の接着を補強します。
手順設定
1.IHC Select® Manual Staining SystemのBase Platformを平らな実験台に設置します。
2.Wicking Padを左から2番目のポジションにセットします。パッドが透明アルミニウム製のNestにぴったり収まるよう、パッドの角を詰め込みます。パッドがぴったり収まったら、パッド表面が平らになるよう上部をならします。パッド表面は、パッドの中心を親指で押しながら、角をそっと持ち上げると平らになります。パッドが正しく設置されている状態とは、Nestにぴったり収まっており、表面が平らになっている状態をいいます。
3.Reagent Trayは、試薬ウェル底部の内側に1～10の番号が付与されています。番号の向きは、Reagent TrayをNestにはめ込む際と、試薬を正しい位置にセットする際に役立ちます。
4.Reagent Trayは透明アルミニウム製のNestに、右側（試薬ウェル底部に番号「10」が記載されている側）から先にはめ込むことによりセットします。Reagent Tray右側のエクステンションは、Nestのスロットに収まります。
5.Reagent Trayの左側を押し下げることにより、Nestにはめ込みます。正しくはめ込まれた場合には、「カチッ」という音がします。トレー左側のエクステンションも、Nestに収まります。正しくはめ込まれていれば、トレー底部の番号が左から順に1～10と読めるはずです。
6.次のポジションに次の部品が装着されれば、最初の準備は完了です。
  1. ポジション 1：Reagent Tray2枚
  2. ポジション2：Pad1枚
  3. ポジション3：Reagent Tray2枚
  4. ポジション4：Reagent Tray2枚
    Reagent Trayを外す際には、トレー左側を中心方向に押すだけで、トレーの縁が持ち上がります。そのような状態になれば、トレーをNestから取り外すことができます。
7.Slide Holderの向きは、前から後、左から右の順番になるようにします。「CHEMICON INTERNATIONAL」という表示と上端の爪かけ1個を前向きに配置します。上端の爪かけ4個を後向きに配置します。顕微鏡用スライドのポジション番号1～10が左から右の順番になるようにします。顕微鏡用スライドの「A」列が前列、「B」列が後列です。この向きは、顕微鏡用スライドを正しい位置にセットするため、またスライドがReagent Trayに入った正しい試薬に確実に浸されるために重要です。

前面が前面に向いていれば、Slide HolderはNestのみにぴったり収まるはずであることに留意してください。
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ホルダーへのスライドの挿入
8.A列およびB列とスライド位置1～10は、Slide Holderの前後両面と底部に表示されています。スライドをセットするため、平らな面にSlide Holderを裏返しに置きます。

注記：Slide Holderが裏返しに置かれている間は、A列のスライドが後側になります。Slide Holderを元の向きに戻せば、A列が前面（操作者側）になります。
9.Capillary Gap Slideを2枚1組にしてSlide Holderにセットします。

注記：各スライドはフロスト部分（「ラベル部分」および「終足（end feet）」）に塗装が施されています。

注記：Capillary Gap Slide2枚のラベル同士を（向かい合わせに）重ねると、塗装面がスライドのガラス表面間に「Capillary Gap」を生み出します。Capillary Gapは約150ミクロンですので、両スライドに組織サンプル（通常4～5ミクロン厚）をのせることができます。
10.スライドペアは「ラベル」部分を下にしてSlide Holderに注意深く挿入します。

注記：スライドは切り欠き部分（notched opening）（A1、A2など）に挿入します。

注記：強度の低いスライドが破損する可能性がありますので、スライドを横方向（「A」列方向）に押さないよう注意してください。スライドペアを番号方向に小刻みに揺らすと、挿入しやすい場合があります。
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11.引き続き、残りのスライドペアをSlide Holderに挿入します。
12.Slide Holderに挿入したスライドペアの下側の位置を、空のスライドグラスの裏側（非塗装側）を用いて揃えます。スライドペアの下端はすべて揃える（「平らにする」）必要があります。

注記：スライドペアの下端を揃えることは、スライドペアからWicking Padに試薬が適切に排出されるためにきわめて重要です。
13.Slide Holderを前向きにして、最初のNestに設置します。

注記：Slide Holderを「前」向きにする際に役立つよう、Slide Holderには次の設計が施されています。
  • Slide Holder上面に、「CHEMICON INTERNATIONAL」という文字が前向きに刻印されています。
  • Slide Holder上面の爪かけ1個は前向き、爪かけ4個は後向きに作られています。
  • Slide Holderは前向きでなければ、「脚部」がNestに設置できないよう設計されています。
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IHCプロトコール
IHCプロトコールの概要（詳細な情報およびIHC試薬については、www.millipore.com/nihonのIHC Select® Detection Reagentの添付文書をご覧ください）。IHC Select®一次抗体、検出試薬および補助製品は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織の染色用に最適化されています。その他のIHC染色を行う場合には、条件を調整する必要があります（インキュベーション時間の変更など）。
  1. スライド上の組織切片からのパラフィン除去（脱パラフィン）を開始する前に、スライドを60 ℃のオーブンで1 ～ 2 時間加熱します。脱パラフィン開始前に、スライドを室温に戻します。
  2. スライドをキシレン（5 分、4 回）、100% エタノール（2 分、2 回）、70% エタノール（2 分、2 回）、30% エタノール（2 分、2 回）、蒸留水または脱イオン水（2 分、2 回）の順に浸漬し、脱パラフィンを行います。
  3. 標的とする抗原（ビメンチンなど）の検出に組織の前処理が必要な場合には（すなわち、エピトープの賦活化、抗原の賦活化とも呼ばれる）、この段階で行います。例えば、エン酸緩衝液pH 6.0 に浸した状態で、蒸し器、オートクレーブ、圧力釜などを用いて前処理します（Battifora et al., 1995）。エピトープの賦活化処理後、組織を徐々に室温に戻します（例えば、蒸し器または圧力釜から取り出し、室温で10 分以上冷ますなど）。
    注記：スライドの脱パラフィン（あるいはエピトープの賦活化）を行っている間に、IHC SelectR ManualStaining System の準備をします。
  4. Streptavidin - HRP およびDAB を使する場合には、切片を3% 過酸化水素で10 分間インキュベーションします。
  5. 切片を1X Rinse Buffer（T-20 含有）で1 分以上すすぎます。
  6. スライド2 枚合わせてスライドペアとし、IHCSelect Slide Holder に挿入します。
    注記：スライドペアは、新たに調製した1X RinseBuffer（T-20 含有）を試薬トレーに入れ、スライド間に浸透させることにより、容易に作ることができます。スライド間に緩衝を浸透させた状態のスライドペアをSlide Holder に挿入します。スライド上の組織は常に乾燥させないようにしてください。
  7. 切片を1X Rinse Buffer（T-20 含有）で30 秒間、5 回すすぎます（1 回のすすぎが終了するごとにWicking Pad 上に静置）。
    注記：スライドはWicking Pad 上に30 秒以上放置しないでください。組織切片が乾燥するおそれがあります。
  8. 液体をWicking Pad に排出します。
  9. 切片をブロッキング試薬でインキュベーションします（5 分間）。
  10. 液体をWicking Pad に排出します。
  11. 切片を1X Rinse Buffer（T-20 含有）で30 秒間、1 回すすぎます。
  12. 液体をWicking Pad に排出します。
  13. 切片を一次抗体または陰性コントロール試薬でインキュベーションします（あらかじめ希釈されているIHC SelectR 一次抗体を使用する場合には、10 分間インキュベーションします）。IHC Select以外の抗体を使用する場合には、タイトレーションを行い、特定の濃度およびインキュベーション時間を決定してください。
  14. 液体をWicking Pad に排出します。
  15. 切片を1X Rinse Buffer（T-20 含有）で30 秒間、5回すすぎます（1 回のすすぎが終了するごとにWicking Pad 上に静置）。
  16. 液体をWicking Pad に排出します。
  17. 切片をビオチン化二次抗体で10 分間インキュベーションします。
  18. 液体をWicking Pad に排出します。
  19. 切片を1X Rinse Buffer（T-20 含有）で30 秒間、5回すすぎます（1 回のすすぎが終了するごとにWicking Pad 上に静置）。
  20. 液体をWicking Pad に排出します。
  21. 切片をストレプトアビジン-酵素複合体でインキュベーションします（SA-HRP の場合には10 分間）。
  22. 液体をWicking Pad に排出します。
  23. 切片を1X Rinse Buffer（T-20 含有）で30 秒間、2回すすぎます（1 回のすすぎが終了するごとにWicking Pad 上に静置）。
    注記：この時、Wicking Pad を（新品のパッドに）交換します。
  24. 切片を1X Rinse Buffer（T-20 含有）で30 秒間、5回すすぎます（1 回のすすぎが終了するごとにWicking Pad 上に静置）。
  25. 液体をWicking Pad に排出します。
  26. 切片を色素原とともにインキュベーションします（DAB の場合には10 分間）。
  27. 液体をWicking Pad に排出します。
  28. 切片を1X Rinse Buffer（T-20 含有）で30 秒間、5回すすぎます（1 回のすすぎが終了するごとにWicking Pad 上に静置）。
  29. 液体をWicking Pad に排出します。
  30. 切片を対比染色液でインキュベーションします（ヘマトキシリンの場合には1 分間）。
  31. 液体をWicking Pad に排出します。
  32. 切片を1X Rinse Buffer（T-20 含有）で30 秒間、5回すすぎます（1 回のすすぎが終了するごとにWicking Pad 上に静置）。
  33. 液体をWicking Pad に排出します。
  34. 切片を蒸留水または脱イオン水ですすぎます（次のステップに進むまで蒸留水または脱イオン水が浸透した状態を保ちます）。
  35. 水系封入剤を用いてカバースリップをのせるか、系列濃度のアルコールとキシレンに浸漬にすることにより脱水し、永久封入剤を用いてカバースリップをのせます。
  36. 透過型光学顕微鏡で観察します。
  37. IHC SelectR Detection Reagent の添付文書には、品質管理および結果の解釈に役立つ情報が記載されておりますので、ご一読ください。

参考資料

Battifora H, Alsabeh R, Jenkins KA, Gown AM: "Epitope Retrieval (Unmasking) in Immunohistochemsitry". Advances in Pathology and Laboratory Medicine, vol. 8, 101–118, 1995.

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